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熒光顯微鏡的出現(xiàn)，讓細(xì)胞器的觀察成為可能，而如果要觀察到更細(xì)致的目標(biāo)，則需要做單分子熒光成像，今天我們就來分享一個今年用TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡做的單分子熒光成像研究：外泌體分泌動力學(xué)受溫度控制。

·為什么使用TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡

全內(nèi)反射熒光顯微鏡MF53-TIRF

TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡是利用光線全反射后形成衰逝波特性，來實現(xiàn)薄區(qū)域熒光觀察的光學(xué)儀器，這種顯微鏡相比常規(guī)熒光顯微鏡（寬場熒光），背景熒光顯著更低，可以實現(xiàn)信噪比更高、細(xì)節(jié)更豐富的熒光成像，尤其適合應(yīng)用于細(xì)胞膜物質(zhì)的動態(tài)觀察。

衰逝波①

衰逝波是一種光學(xué)現(xiàn)象，當(dāng)激發(fā)光以特定角度入射時，會發(fā)生全反射現(xiàn)象，所有激發(fā)光會被反射，靠近反射面的樣品面則會形成一個深度僅幾百納米，光強(qiáng)呈指數(shù)衰減的激發(fā)光，稱為衰逝波。

普通熒光成像與TIRF成像對比①

 利用衰逝波，TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡可以將激發(fā)范圍控制在樣品面極薄的區(qū)域，從而避免了傳統(tǒng)熒光顯微鏡焦面以外的熒光激發(fā)形成的模糊光暈，大大提升了信噪比和分辨率。由于衰逝波光強(qiáng)呈指數(shù)衰減，因此最合適的應(yīng)用是細(xì)胞膜相關(guān)研究。

·外泌體分泌動力學(xué)受溫度控制

我們來看一個論文案例，從中了解TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡的應(yīng)用優(yōu)勢：超高分辨率、動態(tài)觀察。

使用CD63-pHluorin可視化pH敏感蛋白

 使用CD63-pHluorin可視化外泌體與質(zhì)膜融合過程。TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡可以實現(xiàn)單分

子動態(tài)跟蹤觀察，為此需要配備高幀率、高靈敏度的顯微鏡相機(jī)，比如MSH12之類背照式sCMOS科學(xué)相機(jī)。

按成像分析，區(qū)分外泌體不同活動方式②

 單分子熒光成像研究通常涉及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等內(nèi)容，往往需要一定的算法設(shè)計來自動化分析和量化處理，比如本論文使用的就是MATLAB腳本，在github可以下載。

成像分析可靠性驗證，排除溶酶體或囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)②

通過成像分析CD63-pHluorin可視化外泌體與質(zhì)膜融合，排除溶酶體或囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)。

外泌體與質(zhì)膜融合有多種動力學(xué)模式②

算法分析，得出外泌體與質(zhì)膜融合有多種動力學(xué)模式。

外泌體與質(zhì)膜融合事件受溫度控制②

對不同動力學(xué)模式進(jìn)行分析，顯示外泌體與質(zhì)膜融合事件受溫度控制。

模型驗證②

利用模型驗證解釋實驗觀察到的動力學(xué)。

進(jìn)一步的動力學(xué)分析②

外泌體與質(zhì)膜融合前先有對接。

·結(jié)尾

總體而言，全內(nèi)反射熒光顯微鏡MF53-TIRF是細(xì)胞表面物質(zhì)動態(tài)觀察的理想儀器，如固定在蓋玻片或細(xì)胞膜表面上的分子等，在TIRF基礎(chǔ)上明美還有dSTORM超分辨成像方案，有興趣的老師可以跟我們聯(lián)系。

如您對這篇論文感興趣，或者有興趣獲取論文使用的MATLAB自動分析處理腳本，請參考應(yīng)用來源部分信息②。

引用來源：

①Fish KN. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. Curr Protoc. 2022 Aug;2(8):e517. doi: 10.1002/cpz1.517. PMID: 35972209; PMCID: PMC9522316.

②Mahmood A, et al. Exosome secretion kinetics are controlled by temperature. Biophys J. 2023 Apr 4;122(7):1301-1314. doi: 10.1016/j.bpj.2023.02.025. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36814381; PMCID: PMC10111348.